A Mona Lisa, azaz a Gioconda, az európai festészet történetének legismertebb alkotása. Mai szemmel nézve már nem is lehet elvonatkoztatni attól a kultusztól, amely e képet körülveszi. A Mona Lisa köré költött legendák sora a reneszánsz korából ered. Giorgio Vasari a Legkiválóbb festők, szobrászok és építészek életéről írt művében azt írja, hogy Leonardo zenészeket és bohócokat fogadott, hogy modelljének arcáról nem múljék el a mosoly. Majd így folytatja: "A Leonardo festette portrén pedig olyan bájos mosoly látszik, hogy ha az ember ránéz, inkább isteninek, mint emberinek gondolja; csodálatos műnek tartották ezt a képet, hiszen az eleven arc se lehetne különb." (Vasari, 106. o.) Az utókor valóban a híres mosolyt szokta emlegetni Mona Lisaportréjával kapcsolatban, és ennek végső magyarázatát Leonardo festészeti elveiben találhatjuk meg.
A Mona LisaLeonardo szinte egyetlen teljesen befejezett, vitathatatlan attribúciójú műve, amelyet második firenzei korszakában festett, 1503-1505 körül. A portré több szempontból is szakít a firenzei arcképfestés hagyományaival, és hatása már nagyon korán kimutatható, elsősorban Raffaello ekkor készült portréin (Maddalena Doni portréja). A korábbi firenzei portrék általában deréktól fölfelé ábrázolták a modellt, Leonardo ezzel szemben félalakos, ülő beállítást választott, és ez lehetővé tette számára, hogy Mona Lisa kecsesen keresztbe helyezett kezeit is megfesse. Ennek a megoldásnak az előzménye Verrocchio márvány női büsztjében, és egy korábbi Leonardo-portréban, a Ginevra de Benci arcképének beállításában keresendő, bár ez utóbbi képnek a kezeket ábrázoló részletét utóbb levágták.
Mona Lisa félalakos portréja a kép felületének nagy részét elfoglalja, a modell a nézőhöz egészen közel foglal helyet, és fejét enyhe profilba fordítva, tekintetét a nézőre irányítja. Leonardo e műben összegezte mindazokat a festői eszközöket, amelyet az emberi arc, a fény és árnyék kezelése, valamint a táj ábrázolása terén megfigyelései során írásban és rajzban rögzített. Mona Lisa arcának nagyszerűsége is abban ragadható meg, hogy rendkívül finoman kezelt, vetett árnyékok, és az oldalról beeső fény arcának minden részletét plasztikussá teszi, a színek kezelése révén pedig az emberi bőr melegségét és puhaságát szinte kézzel foghatóvá teszi. Leonardo érett kori festményein soha nem használt éles kontúrvonalakat, ezt helyettesítette a sfumato, amely elmosódottá, és egyben plasztikussá teszi a részletformákat. A festő pontosan alkalmazta azt az elvét is, hogy a világos felületeket sötét részletek veszik körül: Mona Lisa arca és kezei az élesen beeső fényben szinte kiemelkednek hajának és ruhájának sötét hátteréből.
A portrét azonban nem csak az arc és a kezek sfumátós megfestése teszi misztikussá, hanem az a háttér is, amely előtt a modell megjelenik. A firenzei portréfestészetben a század közepén, elsősorban Antonio Pollaiuolo arcképein, az általában profilban ábrázolt személy egynemű, égszínkék háttér előtt látható. Csak a németalföldi festők hatására, a század utolsó harmadában találkozunk olyan portrékkal, például Botticellinél vagy Ghirlandaiónál, ahol a modell tájháttér előtt jelenik meg. De ez a tájháttér egészen más, szinte holdbéli tájra emlékeztet. Leonardo itt nem tett mást, mint azt a tájat helyezte Mona Lisa mögé, amelyet már a Sziklás Madonnán, vagy még inkább a Szent Anna harmadmagával (Párizs, Louvre) képeken is alkalmazott. Ennek eredménye egy feszültséggel teli mű, amelyben a közeli modell és a távoli táj között nincs semmiféle kapcsolat. Ezt az ellentétet az is fokozza, hogy Mona Lisát nyilván zárt helyiségben festette meg, a megvilágítás nem természetes, míg a mögötte kibontakozó, párás levegőben vibráló, levegőperspektívával ábrázolt sziklás táj Leonardo milánói korszakának tapasztalatait rögzíti. Az eredmény, Mona Lisa portréja, olyan mű, amely teljesen megváltoztatta a portréfestészet szabályait, és elementáris hatást gyakorolt az érett reneszánsz, a cinquecento művészetére.